病理學園地
您的位置:首頁 > 實驗技術 > 病理生理學

彌散性血管內凝血的造病和實驗室檢測

【目的要求】

1.通過DIC動物模型的復制,進一步了解DIC的病因及發病機制。

2.聯系理論觀察急性DIC各期血液凝固性的變化,并討論發生這些變化的原因及其病理意義。

3.了解DIC的診斷標準,熟悉常用的實驗室檢查指標及其意義。

【實驗原理】

通過靜脈注入兔腦粉浸液,啟動外源性凝血系統而導致DIC。

【實驗動物】

家兔,體重? 1.5~2.0 kg。

【藥品與器材】

1%普魯卡因,3.8%枸櫞酸鈉,血小板稀釋液,兔腦勻漿,0.7%肝素。

兔手術臺,電子稱,顯微鏡,離心機,721型分光光度計,水浴箱、手術器械,微量加樣器,動脈插管,血小板計數板,10 ml、5m1注射器各2支、肝素抗凝管3支、枸櫞酸鈉抗凝管3支。

【實驗步驟】

1.稱重、麻*醉和固定動物 家兔稱重,固定于兔手術臺,頸前部手術野剪毛備皮。抽取1%普魯卡因2ml在手術切口部位作局部麻*醉,作頸前正中切口(切口位置應低于甲狀軟骨水平,切口長度約4~5cm)。分離家兔一側頸總動脈(長度約3~3.5cm),用動脈夾夾閉頸總動脈近心端,遠心端結扎,向心臟方向插管,結扎固定插管。

2.取預先準備的肝素抗凝管和枸櫞酸鈉抗凝管(含枸櫞酸鈉0.3ml)各3個,實驗者應分別做好取血次序的標記。

3.用作正常對照的各項指標的血標本的制備

取測定血小板和其它出、凝血指標用的血標本時,放松動脈夾,最先流出的數滴血應棄去。

(1)先用一小塊玻璃紙,接取兔血一大滴,并立即取其中10ml血液放入2.0ml血小板稀釋液內充分混勻,作血小板計數(方法見附錄)。

(2)然后分別在肝素抗凝管內放入兔血1.5ml,在枸櫞酸鈉抗凝管放入兔血3.5ml(取血完畢用生理鹽水沖洗動脈插管以防管內血液凝固)。

取血管應迅速用小片玻璃紙封閉試管口,上、下顛倒試管使血液與抗凝劑混勻(注意勿震蕩),平衡后離心3000 rpm? 10min,小心取出上層血漿,另置干凈小試管,并加上標記。肝素抗凝所制備的血漿用以測定纖維蛋白原,枸櫞酸鈉抗凝所制備的血漿用以測定PT和3P試驗(方法見附錄)。

4.DIC的造病

取37℃水浴預熱和保溫中的兔腦勻漿,劑量以8ml/Kg體重計算,經耳緣靜脈以1ml/min的速度勻速推注。若注射過程中發現動物突然掙扎、呼吸急促,應立即停止推注并及時采血,方法同步驟3。

5.分別在全量兔腦勻漿注射完畢后的即刻、注射后30或45min時(視手術所用時間長短和實驗課時多少決定)各采血樣一次,方法同步驟3。

6.按照附錄的方法,進行血小板計數,PT測定,3P試驗和纖維蛋白原含量的測定。

7.實驗完畢后,將動物處死。

【附錄】

1.血小板計數(BPC)

用微量加樣器吸取10μl兔全血,擦凈吸頭外的血液,迅速加入到預先準備的2ml血小板稀釋液中,充分混勻后,用滴管將試管內已稀釋血液滴到計數板上靜置10min,等血小板完全下沉后,用高倍鏡計數,注意:

(1)要準確數出計數板中央l大方格(即25個中格400小格)的血小板數,乘以2000就是每立方毫米的血小板數,或者在中央1大方格內,準確計數四個角上的中格和中央的1個中格,一共5個中格的血小板數,乘以1萬就是每立方毫米的血小板數。

(2)在高倍鏡下,血小板體積甚小,在大量紅細胞中間是個小圓點,調整顯微鏡的微調時,可以見到小圓點(血小板)應有較強的折光性。

2.凝血酶原時間(Prothrombin Time簡稱PT)

(l)取被檢血漿0.lml,置于小試管內,放入37℃水浴預溫。

(2)在上述試管內加入P試液0.2ml,同時開動秒表并輕輕地側動試管,至液體停止流動或出現顆粒為止,即為凝固終點,立即停止計時,記錄PT測定值(秒)。

(3)重復3次測定,取平均值作為測定結果。

正常參考值:人12±1s,兔6~8秒,狗7.3~10s。

3.血漿魚精蛋白副凝試驗(3P試驗)

(l)取被檢血漿0.5ml,置于小試管內,放入37℃水浴3min預溫。

(2)在上述試管內加入硫酸魚精蛋白液50ml,混勻,在37℃水浴中放置15min。在觀察結果時,將試管輕輕地搖動,有白色纖維或凝塊為陽性;完全混濁無白色纖維為陰性。

4.纖維蛋白原定量

飽和氯化鈉法

(l)取血漿0.5ml,置于12×100ml的試管中,加入飽和NaCl溶液4.5ml,充分混勻,置37℃水浴中,溫育3min,取出后再次搖勻。

(2)對照管試液的配置處理:取生理鹽水0.5ml加入飽和NaCl溶液4.5ml進行同樣操作。

(3)選用波長520毫微米,以對照管試液調定光密度測定儀的零點,然后測定被測樣品試液的光密度,按下式計算樣品中纖維蛋白原的含量。

纖維蛋白原含量的計算公式: 測定光密度/0.5*1000=mg%

【注意事項】

1.采集抗凝血需掌握好血液與抗凝劑的比例。

2.注射兔腦勻漿前,要做好第二次采血的一切準備工作,準備好抗凝管、玻片、秒表。這因為注射兔腦勻漿過程中,動物極易猝死,如到臨時再作準備,則往往因準備不及,動物已死亡,采不到血。

3.靜脈推注兔腦勻漿的速度快慢是實驗成敗的關鍵,故在控制好速度的前提下,應密切注意動物的反應。

【思考題】

1.靜脈注入兔腦浸液后為何能復制出家兔DIC模型?試述其發生機制。

2.根據實驗中的血液學實驗結果,討論急性DIC產生的原因、機制及各項結果間的關系。

【實驗結果記錄】

注入兔腦勻漿前后動物呼吸與狀態觀察
  注兔腦勻漿前 注兔腦勻漿后
腹式呼吸    
一般狀態    

DIC實驗指標的測定記錄
項目 注射前 注射后(立即) 注射后(30/60分鐘)
BPC      
PT(sec)      
3P試驗      
Fbg定量      

糾錯留言 | 網站導航 | 站內搜索 | 關于我們 | 聯系站長
Copyright©2006-2017 病理學園地*Pathology Information Web
昨天晚上3d开奖结 短线股票推荐网每日 重庆快乐十分一定牛 股票分析师月收入多少 河南泳坛夺金玩法如何中奖 pc蛋蛋高手 浙江6+1app 山东十一选五开奖结果查 3d百位定胆绝招 快乐十分前三组选高手 手机股票分析软件排行榜